এলএনপি-ভিত্তিক জিন থেরাপি ওষুধের এলসিএমএস প্রিক্লিনিক্যাল জৈব বিশ্লেষণ

জেনেটিক রোগগুলি এখনও একটি বিশ্বব্যাপী চ্যালেঞ্জ, কারণ এগুলি জিনের মিউটেশনের কারণে ঘটে যা জৈবিক ক্রিয়াকলাপ, বিপাকীয় প্রক্রিয়া বা ব্যক্তির নির্দিষ্ট প্রয়োজনীয় প্রোটিনের উত্পাদনকে প্রভাবিত করে, বিভিন্ন উত্তরাধিকারসূত্রে প্রাপ্ত ব্যাধিতে। জিন থেরাপির ওষুধ হল এক ধরনের থেরাপিউটিক হস্তক্ষেপ যা নির্দিষ্ট জিনকে লক্ষ্য করে, তাদের মেরামত বা সংশোধন করার লক্ষ্য রাখে এবং কোষের জন্য কার্যকরী প্রোটিন তৈরি করতে বা রোগ সৃষ্টিকারী জিনের ত্রুটিগুলিতে হস্তক্ষেপ করার জন্য নতুন নির্দেশনা প্রদান করে।

সাধারণ জিনের ওষুধের মধ্যে প্রধানত ডিএনএ এবং আরএনএ অন্তর্ভুক্ত থাকে, যেখানে ডিএনএ হতে পারে জিনের টুকরো বা থেরাপিউটিক প্রভাব সহ জিনের ক্রম। এই ডিএনএগুলি ত্রুটিপূর্ণ বা অনুপস্থিত জিনের কার্যাবলী প্রতিস্থাপন বা সম্পূরক করার জন্য কোষগুলিতে বিতরণ করা হয়। RNA হতে পারে মেসেঞ্জার RNA (mRNA), ছোট হস্তক্ষেপকারী RNA (siRNA), বা antisense oligonucleotides (ASO), ইত্যাদি, যা ক্ষতিকারক জিনের প্রকাশকে সংশোধন করতে, বাধা দিতে বা নির্দিষ্ট জিনের কার্যকারিতা পুনরুদ্ধার করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।

যাইহোক, ডিএনএ এবং আরএনএ উভয়ই মানবদেহে প্রবেশ করা থেকে লক্ষ্য কোষে পৌঁছানোর জন্য অনেক চ্যালেঞ্জের মুখোমুখি হয়। যেহেতু জিন ক্রমগুলি গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টে অস্থির, সেগুলি সাধারণত শিরায় বা সাবকুটেনিয়াস ইনজেকশন দ্বারা পরিচালিত হয়, তবে তা সত্ত্বেও, বেশিরভাগ জিন ক্রমগুলি এখনও মানবদেহে প্রচুর নিউক্লিয়াস দ্বারা ক্ষয়প্রাপ্ত হয়।

যখন অল্প পরিমাণে অবশিষ্ট জিনের ওষুধ লক্ষ্য কোষের বাইরে পৌঁছায়, তখন তারা কোষে প্রবেশ করতে পারে না কারণ জিনের ক্রমগুলি ফসফেট গ্রুপগুলির সাথে নেতিবাচক চার্জ বহন করে বড় অণু, যখন কোষের ঝিল্লিও নেতিবাচক চার্জ বহন করে। যখন দুটি নেতিবাচক চার্জ মিলিত হয়, জিনগুলি বিকর্ষণ হয় এবং কোষে প্রবেশ করতে পারে না। তাই, আমাদের ভিভোতে তাদের অবক্ষয় রোধ করতে এবং কোষের ঝিল্লি অনুপ্রবেশের দক্ষতা উন্নত করতে এবং কোষে ডিএনএ বা আরএনএ সিকোয়েন্সগুলি মসৃণভাবে সরবরাহ করতে আমাদের নির্দিষ্ট জিন ওষুধ সরবরাহের পদ্ধতি বিকাশ করতে হবে।

জিন ওষুধের জন্য ডেলিভারি পদ্ধতি

বর্তমান সাধারণ জিন বিতরণ পদ্ধতিগুলি প্রধানত দুটি বিভাগে বিভক্ত: ভাইরাল ভেক্টর ডেলিভারি এবং নন-ভাইরাল ভেক্টর ডেলিভারি। ভাইরাল ভেক্টর ডেলিভারিতে প্রধানত অ্যাডেনো-অ্যাসোসিয়েটেড ভাইরাস (AAV) এবং লেন্টিভাইরাস ইত্যাদি অন্তর্ভুক্ত থাকে, যা হোস্ট কোষের ভাইরাস সংক্রমণের প্রক্রিয়াকে অনুকরণ করতে পারে এবং সহজেই কোষের বাধা অতিক্রম করতে পারে, এইভাবে উচ্চ ডেলিভারি দক্ষতা অর্জন করে। যাইহোক, ভাইরাল ভেক্টর ডেলিভারিতেও সমস্যা রয়েছে: প্রথমত, এটির প্যাকেজিং ক্ষমতা সীমিত, যেমন AAV-এর সর্বোচ্চ প্যাকেজিং ক্ষমতা 4.7kb, যা দীর্ঘতর জিন সিকোয়েন্স সরবরাহ করতে পারে না; দ্বিতীয়ত, ভাইরাল ভেক্টরগুলি সেলুলার ইমিউনিটি এবং হিউমারাল ইমিউনিটি সহ গুরুতর ইমিউন প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করতে পারে, যা ক্লিনিকাল অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য ঝুঁকি তৈরি করে। এর সাথে তুলনা করে, অ-ভাইরাল ভেক্টরের নিরাপত্তা এবং ওষুধ লোডিং ক্ষমতার বিশাল সুবিধা রয়েছে।

বর্তমানে সাধারণত ব্যবহৃত নন-ভাইরাল ভেক্টরগুলির মধ্যে প্রধানত লাইপোসোম, পলিমার, ন্যানো পার্টিকেলস, ​​এক্সোসোম ইত্যাদি অন্তর্ভুক্ত থাকে, যার মধ্যে লাইপোসোমগুলি 100nm থেকে 1um পর্যন্ত ব্যাস বিশিষ্ট অ্যাম্ফিফিলিক অণু দ্বারা গঠিত ভেসিকেল। এগুলি প্রধানত ফসফোলিপিড, কোলেস্টেরল, পিইজি লিপিড এবং ক্যাটানিক লিপিড দ্বারা গঠিত। ফসফোলিপিড বিলেয়ার গঠন কোষের ঝিল্লির মতো এবং এন্ডোসাইটোসিসের মাধ্যমে মসৃণভাবে কোষে প্রবেশ করতে পারে। এছাড়াও, লাইপোসোমগুলি নির্দিষ্ট টিস্যু বা কোষকে লক্ষ্য করার সময় শরীরের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা থেকে বাঁচতে তাদের পৃষ্ঠের PEG বা নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলিকেও সংশোধন করতে পারে। ক্যাটানিক লাইপোসোম হল লাইপোসোম যাতে ইতিবাচক চার্জযুক্ত কোয়াটারনারি অ্যামোনিয়াম সল্ট লিপিড থাকে, যা নেতিবাচক চার্জযুক্ত নিউক্লিক অ্যাসিড ওষুধের সাথে আরও ভালভাবে আবদ্ধ হতে পারে এবং বিতরণ ব্যবস্থার স্থিতিশীলতা বজায় রাখতে পারে। তাই, লাইপোসোম হল জিন ওষুধের জন্য সাধারণ নন-ভাইরাল ভেক্টর ডেলিভারি পদ্ধতিগুলির মধ্যে একটি।

যাইহোক, ঐতিহ্যবাহী লাইপোসোমেরও কিছু সমস্যা রয়েছে: প্রথমত, লাইপোসোম ব্যাসের বৃহৎ ব্যবধানের কারণে, যদিও এটি পর্যাপ্ত ওষুধ লোডিং ক্ষমতা নিশ্চিত করতে পারে, যখন লাইপোসোমগুলি ভাস্কুলার এন্ডোথেলিয়াল গ্যাপ (100-200nm) এর মধ্য দিয়ে যায়, খুব বড় আকার এই প্রক্রিয়াটিকে বাধা দেবে। উপরন্তু, লাইপোসোমগুলি এন্ডোসাইটোসিসের মাধ্যমে কোষে প্রবেশ করার পরে এবং এন্ডোসোম-লাইসোসোম সিস্টেম তৈরি করার পরে, ঐতিহ্যগত লাইপোসোমগুলি সময়মতো লাইসোসোমাল এস্কেপ সম্পূর্ণ করতে পারে না, যার ফলে বেশিরভাগ জিনের ওষুধগুলি লাইসোসোম দ্বারা ক্ষয়প্রাপ্ত হয় এবং তাদের প্রভাব প্রয়োগ করতে অক্ষম হয়। জিনের ওষুধ সরবরাহের ক্ষেত্রে ঐতিহ্যবাহী লাইপোসোমের এই ত্রুটিগুলির উপর ভিত্তি করে, লিপিড ন্যানো পার্টিকেলস (এলএনপি) তৈরি করা হয়েছে এবং বিশেষ করে লক্ষ্য কোষ এবং টিস্যুতে নিউক্লিক অ্যাসিড সরবরাহের জন্য উপযুক্ত একটি গুরুত্বপূর্ণ বিতরণ পদ্ধতি হয়ে উঠেছে।

এলএনপি ক্যারিয়ার সিস্টেমের ভূমিকা

লিপিড ন্যানো পার্টিকেল (LNP) হল লিপিড-জাতীয় পদার্থ এবং সাধারণত 10-200nm এর মধ্যে ব্যাস দিয়ে গঠিত ন্যানো পার্টিকেল। ঐতিহ্যবাহী লাইপোসোমগুলির তুলনায়, এগুলি ছোট এবং ভাস্কুলার এন্ডোথেলিয়াল ফাঁক দিয়ে অতিক্রম করা সহজ। উপরন্তু, LNP সাধারণত ক্যাটানিক/আয়োনিজেবল লিপিড, সহায়ক ফসফোলিপিড, পলিথিন গ্লাইকোল (পিইজি) লিপিড এবং কোলেস্টেরল নিয়ে গঠিত। তাদের মধ্যে, অক্জিলিয়ারী ফসফোলিপিড এবং কোলেস্টেরল LNP এর স্থায়িত্ব বাড়াতে পারে; পিইজি লিপিড ভিভোতে এলএনপির সঞ্চালনের সময় বাড়াতে এবং প্রতিরোধ ক্ষমতা কমাতে সাহায্য করে। এই উপাদানগুলির ঐতিহ্যগত liposomes হিসাবে অনুরূপ ফাংশন আছে. পার্থক্যটি ক্যাটানিক/আয়নাইজেবল লিপিডের মধ্যে রয়েছে, যা এলএনপির পেটেন্ট সুরক্ষার প্রধান ক্ষেত্রও।

আগেই উল্লেখ করা হয়েছে, ক্যাটানিক লাইপোসোমগুলি কার্যকরভাবে নিউক্লিক অ্যাসিড ওষুধের সাথে আবদ্ধতা বজায় রাখতে পারে এবং নিউক্লিক অ্যাসিড ওষুধের সরবরাহের দক্ষতা উন্নত করতে পারে। যাইহোক, ক্যাটানিক লাইপোসোমগুলি শরীরের সঞ্চালনে নেতিবাচকভাবে চার্জযুক্ত প্লাজমা প্রোটিন, রক্তকণিকা ইত্যাদির সাথে অ-নির্দিষ্ট আবদ্ধ হওয়ার প্রবণতা রয়েছে, যার ফলে লাইপোসোম একত্রিত হয় এবং দ্রুত শরীর থেকে বের হয়ে যায় (ভিভোতে ক্যাটেশনিক লাইপোসোমের অর্ধেক-জীবন মাত্র 15 মিনিট)।

এই সমস্যা সমাধানের জন্য, গবেষকরা ionizable lipids নামে একটি নতুন ধরনের লিপিড উপাদান তৈরি করেছেন। আয়োনাইজেবল লিপিডগুলি গঠনে ক্যাটানিক লিপিডগুলির সাথে খুব মিল। সাধারণ ক্যাটানিক লিপিড DOTAP এবং ionizable লিপিড DODAP-কে উদাহরণ হিসাবে নিলে, পার্থক্য হল যে DOTAP হল একটি ধনাত্মক চার্জ সহ একটি চতুর্মুখী অ্যামোনিয়াম লবণ, যখন DODAP হল একটি তৃতীয় অ্যামাইন কাঠামো। তৃতীয় অ্যামাইন গঠন লিপিডের pKa কে 6-7 এর মধ্যে রাখতে পারে। যখন pH pKa থেকে কম হয় (অম্লীয় অবস্থার অধীনে), ionizable লিপিডগুলি ইতিবাচকভাবে চার্জ করা হয়।

যখন pH pKa এর কাছাকাছি থাকে (নিরপেক্ষ অবস্থার অধীনে), ionizable লিপিড নিরপেক্ষ হয়। এই নকশাটি চতুরতার সাথে ক্যাট্যানিক লাইপোসোমের সম্মুখীন হওয়া সমস্যার সমাধান করতে পারে: যেহেতু রক্ত ​​সঞ্চালনে pH নিরপেক্ষ, তাই আয়নযোগ্য লিপিডগুলিও নিরপেক্ষ, এবং তাদের এবং প্লাজমা প্রোটিন বা রক্তকণিকার মধ্যে অ-নির্দিষ্ট আবদ্ধতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়, অর্ধেক-জীবন প্রসারিত করে। উপরন্তু, যখন আয়নযোগ্য লিপিড এলএনপি কোষ দ্বারা গ্রহণ করা হয় এবং লাইসোসোমে প্রবেশ করে, তখন লিপিডগুলি আয়নিত হয় এবং লাইসোসোমাল পরিবেশে pH 5-6 এর সাথে ইতিবাচকভাবে চার্জ করা হয়। ইতিবাচক চার্জযুক্ত লিপিডগুলি সহজেই এন্ডোসোম-লাইসোসোম ঝিল্লির সাথে মিশ্রিত হয়, যার ফলে লাইপোসোমগুলি সাইটোপ্লাজমে পালাতে পারে, নিউক্লিক অ্যাসিডগুলিকে বিচ্ছিন্ন করে এবং ছেড়ে দেয়, এইভাবে তাদের প্রভাব প্রয়োগ করে। সারসংক্ষেপে, LNP ক্যারিয়ার সিস্টেম ডিজাইন করার ক্ষেত্রে লিপিড কম্পোজিশন, কণার আকার, সারফেস চার্জ এবং স্থায়িত্ব কার্যকরী জিন ডেলিভারি অর্জনের জন্য অপ্টিমাইজ করা জড়িত।

এলএনপি-প্যাকেজড জিন ওষুধের জন্য LCMS জৈব বিশ্লেষণ কৌশল

LNP-প্যাকেজ করা জিনের ওষুধগুলি মূলত LNP শেল এবং জিন ড্রাগ নিয়ে গঠিত। LNP শেলে প্রধানত লিপিড উপাদান থাকে (cationic/ionizable লিপিড প্রায় 30-50%, PEG লিপিড প্রায় 2%, কোলেস্টেরল প্রায় 20-50%, অক্জিলিয়ারী ফসফোলিপিড প্রায় 10-20%) থাকে, যখন জিন ওষুধের উপাদান, প্রধানত ওষুধের জিন। ASO, siRNA এবং miRNA, ইত্যাদি)। NMPA এবং FDA[14-15]-এর সর্বশেষ প্রবিধান অনুসারে, LNP-এর মতো ওষুধ সরবরাহ ব্যবস্থার ওষুধের IND প্রয়োগের জন্য, সক্রিয় উপাদান (জিন ক্রম) এর উপর ফার্মাকোলজিকাল এবং ফার্মাকোকিনেটিক অধ্যয়ন পরিচালনার পাশাপাশি, নিরাপত্তা এবং ফার্মাসিউটিক্যাল মূল্যায়নের জন্যও প্রয়োজন হয় নতুন লিপিড উপাদানগুলির জন্য যে ওষুধ বাজারে ব্যবহার করা হয় না। Cationic/ionizable লিপিড এবং PEG লিপিড LNP-তে বিশেষ পরিবর্তন সহ।

এলএনপি লিপিডের LCMS জৈব বিশ্লেষণ ক্যাটানিক/আয়োনিজেবল লিপিড এবং পিইজি লিপিডের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে। তাদের মধ্যে কাঠামোগত পার্থক্যের কারণে, ক্যাটানিক/আয়নাইজেবল লিপিড আণবিক ওজন সাধারণত 1 kDa-এর মধ্যে থাকে, যখন PEG লিপিড আণবিক ওজন পরিবর্তন গোষ্ঠীগুলি বহন করার পরে 2~5 kDa-এ পৌঁছতে পারে, যার ফলে তাদের মধ্যে ক্রোমাটোগ্রাফিক ধারণ এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি প্রতিক্রিয়াতে বড় পার্থক্য দেখা দেয়। এলএনপি-তে ক্যাটানিক/আয়নাইজেবল লিপিডের বিষয়বস্তু পিইজি লিপিডের তুলনায় বেশি বলে বিবেচনা করে, প্রতিক্রিয়া পার্থক্য উভয়ের প্রিট্রিটমেন্ট পদ্ধতিগুলিকে কার্যকরভাবে একত্রিত করতে অক্ষমতার দিকে নিয়ে যায় (নিষ্কাশন দ্রাবক নির্বাচন, তরলীকরণ ফ্যাক্টর নির্ধারণ)। উপরন্তু, পিইজি লিপিডের শীর্ষ অবস্থানের চারপাশে অনেক হস্তক্ষেপকারী চূড়ার উপস্থিতির কারণে, কার্যকর বিচ্ছেদের জন্য একটি দীর্ঘতর তরল ফেজ বিভাজন গ্রেডিয়েন্ট প্রায়ই প্রয়োজন হয়, যা উচ্চ বিশ্লেষণ দক্ষতার নিশ্চয়তা দিতে পারে না। অতএব, আমরা আলাদাভাবে জৈব বিশ্লেষণে পিইজি লিপিড সনাক্তকরণ পদ্ধতি স্থাপন করি। একই সময়ে, cationic/ionizable লিপিড এবং PEG লিপিডেরও তাদের লিপিড উপাদানগুলির কারণে পদ্ধতির বিকাশে সাধারণ অসুবিধা রয়েছে, যেমন জলে দুর্বল দ্রবণীয়তা, জৈবিক ম্যাট্রিক্সে অস্থিরতা, পুনরুদ্ধারের সীমা অতিক্রম করার জন্য প্রোটিন বাঁধাই, উচ্চ হস্তক্ষেপ এবং পিইজি লিপিডের অবশিষ্টাংশ, ম্যাট্রিক্সের অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড নির্বাচনে স্থিতিশীলতার নমুনা পরিবর্তন এবং কঠিন অভ্যন্তরীণ নমুনা পরিবর্তন।